EBOOK Badania nad ekspresją i funkcją genu i białka ATP7A (ATPazy transportującej kationy miedziowe)

e-ISBN: 978-83-233-8406-9

Tematem monografii są wyniki badań funkcji genu i białka ATP7A - transportera kationów miedzi, przedstawione na szerokim tle roli jonów miedzi w prawidłowym rozwoju i działaniu organizmu. Od kiedy stwierdzono, że wiele enzymów do skutecznego funkcjonowania potrzebuje obecności kofaktorów, którymi między innymi są jony miedzi, stało się jasne, dlaczego niedobory tego pierwiastka prowadzą do licznych nieprawidłowości rozwojowych. Bardzo ciekawym aspektem badań nad tym problemem jest możliwość wykorzystania mysiego modelu niedoboru miedzi do badań choroby Menkesa u ludzi. Inna strona tego zagadnienia to nadmierne odkładanie jonów miedzi w mózgu i wątrobie u chorych na chorobę Wilsona, co również prowadzi do nieprawidłowości. Dlatego tak istotne jest poznanie na poziomie molekularnym procesów związanych z wchłanianiem, transportem i metabolizmem miedzi.
Z recenzji prof. dr hab. Anny Lityńskiej
1. WSTĘP  11
1.1. Wchłanianie i transport miedzi w organizmie  13
1.2. Pobieranie i transport miedzi w obrębie komórki  14
1.3. Geny ATP7A/Atp7a kodujące białka ATP7A u człowieka i u myszy  19
1.4. Budowa białka ATP7A – ATPazy transportującej kationy miedziowe 21
1.5. Dziedziczne zburzenia metabolizmu miedzi u człowieka spowodowane mutacjami w genach ATP7A i ATP7B  24
1.6. Charakterystyka mutacji mottled u myszy  26
1.7. Charakterystyka mutacji mosaic (Atp7a mo-ms)  29
2. CEL BADAŃ  31
3. MATERIAŁ I METODY  33
3.1. Materiał biologiczny  33
3.1.1. Zwierzęta  33
3.1.2. Linie komórkowe  33
3.2. Analiza ekspresji genu Atp7a w wątrobie samców myszy w różnych okresach życia postnatalnego  34
3.2.1. Izolacja RNA z organów i komórek  34
3.2.2. Odwrotna transkrypcja uzyskanego RNA  34
3.2.3. Reakcja RT-PCR 35
3.2.4. Analiza sekwencji genu Atp7a w wątrobie  36
3.2.5. Wykrywanie ekspresji genu Atp7a metodą Real-Time PCR  36
3.2.6. Wykrywanie ekspresji białka ATP7A metodą Western-blot  37
3.2.7. Oznaczanie zawartości miedzi w wątrobie  38
3.3. Porównanie ekspresji genu Atp7a oraz zawartości miedzi w organach wewnętrznych myszy o genotypie dzikim oraz samców mutantów mosaic  39
3.3.1. Izolacja RNA z organów badanych samców  39
3.3.2. Odwrotna transkrypcja RNA  39
3.3.3. Analiza ekspresji genu Atp7a metodą Real-Time PCR genu Atp7a w wątrobie samców mosaic i myszy o genotypie dzikim metodą RT-PCR  39
3.3.5. Analiza zawartości miedzi w organach wewnętrznych  40
3.4. Analiza sekwencji genu Atp7a u samców mutantów mosaic  40
3.4.1. Izolacja genomowego DNA  40
3.4.2. Reakcja PCR  40
3.4.3. Sekwencjonowanie genu Atp7a u samców mosaic  42
3.5. Analiza ekspresji, aktywności i wewnątrzkomórkowa lokalizacja białka ATP7A u myszy o genotypie dzikim i samców mutantów mosaic  42
3.5.1. Przygotowanie materiału do analizy immunohistochemicznej  42
3.5.2. Analiza ekspresji białka ATP7A w nerkach samców mutantów metodą Western-blot  44
3.6. Analiza histologiczna nerek samców mutantów i myszy o genotypie dzikim  44
3.6.1. Oznaczanie zawartości miedzi w nerkach samców mutantów i samców kontrolnych  44
3.6.2. Przygotowanie materiału do analizy histologicznej  44
4. WYNIKI  47
4.1. Analiza ekspresji genu Atp7a, białka ATP7A oraz zawartości miedzi w wątrobie samców myszy o genotypie dzikim w różnych okresach życia postnatalnego  47
4.1.1. Analiza ekspresji genu Atp7a w wątrobie  47
4.1.2. Analiza ekspresji białka ATP7A w wątrobie myszy o genotypie dzikim  52
4.1.3. Analiza zawartości miedzi w wątrobie myszy o genotypie dzikim  55
4.2. Porównanie poziomu ekspresji genu Atp7a oraz zawartości miedzi w organach wewnętrznych myszy o genotypie dzikim oraz samców mutantów mosaic  55
4.2.1. Analiza ekspresji genu Atp7a i zawartości miedzi w mózgu  56
4.2.2. Analiza ekspresji genu Atp7a i zawartości miedzi w nerce  59
4.2.3. Analiza ekspresji genu Atp7a i zawartości miedzi w wątrobie  62
4.3. Analiza sekwencji genu Atp7a u samców mutantów mosaic  66
4.4. Porównanie ekspresji, wewnątrzkomórkowej lokalizacji i aktywności białka ATP7A u myszy o genotypie dzikim i mutantów mosaic  67
4.4.1. Porównanie ekspresji białka ATP7A u myszy dzikich i samców mosaic  68
4.4.2. Porównanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji i aktywności białka ATP7A u myszy dzikich i mutantów mosaic  68
4.5. Wpływ zaburzeń aktywności białka ATP7A na budowę i funkcję nerki na przykładzie mutantów mosaic  70
4.5.1. Analiza zawartości miedzi w nerkach samców mutantów i samców kontrolnych  72
4.5.2. Morfologia i wyniki analizy histologicznej nerek samców mutantów i samców kontrolnych  72
5. DYSKUSJA  83
5.1. Ekspresja genu Atp7a u myszy o genotypie dzikim   83
5.2. Porównanie poziomu ekspresji genu Atp7a i zawartości miedzi u myszy o genotypie dzikim i mutantów mosaic  87
5.2.1. Ekspresja genu Atp7a i zawartość miedzi w wątrobie  88
5.2.2. Ekspresja genu Atp7a i zawartość miedzi w mózgu  88
5.2.3. Ekspresja genu Atp7a i zawartość miedzi w nerkach  93
5.3. Brak aktywności białka ATP7A u mutantów mosaic jako wynik mutacji w genie Atp7a  95
5.4. Uszkodzenia nerki u samców mutantów mosaic wywołane brakiem aktywności białka ATP7A  103
6. WNIOSKI  109
7. STRESZCZENIE  111
8. SUMMARY 115
9. PODZIĘKOWANIA  119
10. PIŚMIENNICTWO  121