EBOOK Molekularne techniki analizy RNA. Ćwiczenia - Praca zbiorowa

EBOOK Molekularne techniki analizy RNA. Ćwiczenia
4.00 Oceń książkę!

Autor: Praca zbiorowa

 Wydawnictwo: Uniwersytet Warszawski
ISBN: 9788323512325
EAN: 667A6CBBEB
Format: 0,0 x 0,0 x 0,0
Oprawa: ...
Stron: 64
Data wydania: 2013
Gdzie kupić tanią książkę?
Selkar
książka
10.00zł
Kup książkę
Książka w Twoim domu w ciągu 48h
Ćwiczenia
Prezentowane w publikacji techniki są obecnie stosowane w większości laboratoriów zajmujących się biologią molekularną, ale ciągle brak ich opisu w literaturze polskojęzycznej. Wykłady do fakultetu "Molekularne techniki analizy RNA" obejmują aktualny stan wiedzy na temat metabolizmu RNA u eukariontów oraz teorię technik pozwalających na badanie poziomu RNA w komórce, nowo syntetyzowanego transkryptu oraz badania oddziaływań białek uczestniczących w transkrypcji.

Na ćwiczeniach praktycznych studenci poznają wybrane techniki badania RNA na przykładzie organizmów modelowych: drożdży Saccharomyces cerevisiae oraz rzodkiewnika Arabidopsis thaliana.

Prezentacja metod jest ilustrowana odpowiednimi przykładami, w których studenci samodzielnie badają poszczególne rodzaje RNA, jak utajnione, niestabilne transkrypty CUT czy microRNA, i etapy ich metabolizmu. Skrypt ten zawiera zarówno wprowadzenie teoretyczne odwołujące się do najnowszych pozycji literaturowych, jak i opis wykonania poszczególnych eksperymentów.

Skrypt adresowany do osób zainteresowanych metabolizmem RNA oraz nowoczesnymi, molekularnymi technikami jego badania - studentów wszystkich kierunków Wydziału Biologii i Międzywydziałowych Indywidualnych Studiów Matematyczno-Przyrodniczych Uniwersytetu Warszawskiego.
Wstęp   7

1. Analiza northern - detekcja RNA na filtrach. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży      9

Opis i cel doświadczenia      9

ĆWICZENIE 1. Izolacja całkowitego RNA z różnych organizmów oraz ocena jakościowa uzyskanego preparatu           10

Metody izolacji RNA            10
RNazy            10
Dobra praktyka laboratoryjna            11
Inhibitory RNaz           11
Przechowywanie RNA            12
Ocena jakości RNA         12
Izolacja całkowitego RNA z komórek drożdżowych      13
Literatura             14

ĆWICZENIE 2. Elektroforetyczny rozdział RNA w żelu agarozowym i ocena jakości RNA           15

Technika northern           15
Znakowanie izotopowe         15
Znakowanie nieizotopowe           15
Detekcja znaczników nieradioaktywnych        16
Elektroforeza RNA z drożdży w żelu agarozowym w warunkach denaturujących      16
Transfer kapilarny            17

ĆWICZENIE 3. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży - hybrydyzacja     18

Skład buforów         18
Procedura hybrydyzacji           18
Odpłukanie nadmiaru sond           18
Wizualizacja hybrydyzacji            18
Literatura         18

2. Analiza northern - wykrywanie transkryptów CUT u drożdży  20

Wstęp             20
Co to są CUTy?         20
Funkcje CUTów            21
Literatura          21

ĆWICZENIE 4. Elektroforeza RNA w denaturującym żelu poliakrylamidowym    23

Elektroforeza RNA w 6% żelu poliakrylamidowym z 7 M mocznikiem      23
Transfer elektryczny mokry           23

ĆWICZENIE 5. Hybrydyzacja RNA na membranie z sondą radioaktywną specyficzną wobec IGS1-R, wyznakowaną metodą "random-priming"       24

3. Wykrywanie małych RNA        25

Wstęp            25
Małe interferujące RNA: miRNA i siRNA        25
Wybrane metody detekcji małych RNA (iRNA)       26
Literatura          28

ĆWICZENIE 4. Pulsacyjny RT-PCR, cz. 1 - pulsacyjna odwrotna transkrypcja             29

Materiały          29
Trawienie DNazą            29
Pulsacyjna odwrotna transkrypcja        29

ĆWICZENIE 5. Reakcja PCR - cz. 2         31
ĆWICZENIE 6. Rozdział w żelu agarozowym produktów pulsacyjnego RT-PCR     32

Przygotowanie próbek           32

4. Badanie końców cząsteczek RNA na przykładzie drożdżowych prekursorów snoRNA. Technika cRT-PCR       33

Wstęp             33
RNaza H           33
Ligacja RNA          34
Literatura          34

ĆWICZENIE 6. Trawienie RNazą H i ligacja RNA       35

Trawienie RNazą H         35
Ligacja RNA           36

ĆWICZENIE 7. Reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR      37

Reakcja odwrotnej transkrypcji       37
PCR              37

ĆWICZENIE 8. Elektroforeza produktów PCR        38

5. PCR ilościowy: RT-qPCR         39

Wstęp           39
Formaty detekcji produktów qPCR        39
Kontrola jakości RNA            40
Analiza doświadczeń qPCR          40
Najbardziej kluczowe elementy RT-qPCR          41
Literatura          42

ĆWICZENIE 8. Projektowanie starterów do qPCR - konkurs na najlepszą parę starterów  43

Wskazówki do projektowania starterów           43
Wykonanie ćwiczenia           44

ĆWICZENIE 9. Testowanie zaprojektowanych starterów do qPCR     45

Przygotowanie starterów           45
Przygotowanie reakcji qPCR         45

ĆWICZENIE 10. Analiza reakcji qPCR         46

6. Oznaczenia aktywności enzymów biorących udział w obróbce RNA      47

Oznaczanie aktywności enzymów hydrolizy kapu        47
Struktura kapu transkryptów polimerazy RNA II          47
Hydroliza kapu             48
Badanie enzymatycznej hydrolizy kapu        49
Oznaczanie aktywności endonukleazy Rnt1         50
Endonukleazy z rodziny RNazy III           50
Rnt1           51
Biogeneza sn/snoRNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae, rola Rnt1      52
Literatura          53

ĆWICZENIE 11. Analiza aktywności Rnt1 w ekstrakcie drożdżowym     55

Protokół          55

7. Analiza oddziaływania białka z kwasem nukleinowym: test opóźnienia migracji w żelu (EMSA)        58

Wstęp            58
Analiza EMSA          58
Terminacja transkrypcji polimerazy RNA I       59
Literatura          60

ĆWICZENIE 12. Wiązanie Reb1 do IGS1 rDNA in vitro      61

Badane warianty IGS1 rDNA S. cerevisiae       61
Wiązanie białka do DNA         61
Rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym          61

8. Sztuczne microRNA - amiRNA   63

Wstęp            63
Wybrane zalety amiRNA         64
Wady amiRNA             64
Literatura          64

ĆWICZENIE 13. Projektowanie amiRNA       64

Książka "EBOOK Molekularne techniki analizy RNA. Ćwiczenia"
Praca zbiorowa